Gateway技术：克隆、表达新方法
Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 同时将您的基因转移到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。图1 Gateway技术的灵活性目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。此外，由于在重组时DNA片段的阅......阅读全文
Gateway技术：克隆、表达新方法
Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 同时将您的基因转移到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达 一、一种更好的克隆方法 Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大
Gateway技术：克隆、表达新方法
Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克
Gateway技术：克隆、表达新方法
Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 同时将您的基因转移到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基
Gateway克隆技术BP反应构建入门载体与LR反应构建表达载...
Gateway克隆技术-BP反应构建入门载体与LR反应构建表达载体的区别 提到克隆、重组载体，就想到5字金言：分、切、连、转、筛，“分”是指分离制备合格的待操作的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DN
原核表达——基因克隆技术
原核表达可以用于检测（1）发生在原核生物内的基因表达。（2）通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。实验方法原理一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag
表达基因的克隆策略与分离表达基因序列的技术方法
人类基因组计划的主要任务之一就是要从大片段基因组区域或整条染色体DNA 上鉴定出基因表达序列(gene expressed sequences)或转录单位(transcription units)。在人类基因组30亿个碱基对中，发生转录的表达序列(即基因)仅占总序列的3～5％。基因组中绝大部
各家cDNA文库构建试剂盒优缺点比较
Invitrogen的:采用的是Gateway技术：利用λ噬菌体位点特异重组系统的BP和LR双向反应，首先将PCR产物用传统方法克隆到Gateway化的入门载体，这个目标基因就可以迅速方便而且定向地重组到任何Gateway化的表达载体上.优点:1无需限制酶切、无需连接，只要利用重组酶就可以穿梭于任何
重组表达cDNA克隆的血清学分析技术介绍
中文名称重组表达cDNA克隆的血清学分析技术英文名称serological analysis of recombinantly expressed cDNA clone;SEREX定 义用肿瘤患者血清从肿瘤细胞cDNA表达文库中筛选和寻找肿瘤抗原基因的方法。应用学科免疫学（一级学科），免疫病理、临
Gateway的原理
Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA
分子克隆蛋白表达实验指南（十八）
15％胶 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5 30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆蛋白表达实验指南（三）
若有非特异性条带，可进行Touchdown PCR，提高引物的特异性。 PCR反应条件： 1 94C 5min 2 94C 45s 3 65C 45s 退火温度视
分子克隆蛋白表达实验指南（十六）
Amp(50mg/ml) 溶解1g Amp于足量的水中，最后定容至20ml。分装成小份于-20℃贮存。常以20～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基，1:1000比例稀释 Kan(50mg/ml) 溶解1g Kan于足量的水中，最后定容至20ml
分子克隆蛋白表达实验指南（四）
7. PCR产物与TA载体连接 pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed. +A s
小鼠βactin基因的克隆表达（2）
实验步骤： （1）目的基因与表达载体的连接反应： ①表达载体和目的片段的酶切 管号 ① ② pGEX 4T-1
分子克隆蛋白表达实验指南（十二）
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 Å 0.5
分子克隆蛋白表达实验指南（十一）
SDS-PAGE胶样品排列： MarkerUII 37CUI’I’ Marker：低分子量蛋白marker，上样10ul UI：未诱导菌液，上样10ul。任取37C和20C中一个 I：诱导后对照，上样10ul UI’, I’代表G
小鼠βactin基因的克隆表达（3）
（2）质粒的提取及酶切鉴定分析 质粒的提取按照质粒提取试剂盒的操作步骤进行，然后进行双酶切鉴定。 管号 ① ② 质粒DNA
小鼠βactin基因的克隆表达（1）
动物组织RNA的提取实验目的：掌握由动物组织中提取总RNA的方法实验原理：Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液，其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性，随后加入氯仿，酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中，RNA
分子克隆蛋白表达实验指南（六）
10. 测序 突变后氨基酸序列没有变化仍可用于表达。测序报告中blast时若有‘－’符号，则人工对照测序图谱。 测序验证后没有突变或者同义突变的重组质粒必须小抽，50ul，conc300ug/ml备份。测序文件应妥善保存，蛋白表达完成后一并提交存档。 获得GS后，即可构建含GE的重组T载体，用
分子克隆蛋白表达实验指南（一）
目的基因克隆包括保存用全长基因(gene for saving, GS)和表达用全长基因(gene for expression, GE)两部分。 这两部分所克隆的基因都是全长片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精确克隆(及引物从基因CDS两端开始)很难找到高效价的引物，且cDNA中目的基
分子克隆蛋白表达实验指南（十七）
Buffers for His purification in denatured conditions: 配制时加终体积50％的水，之后定容至所需体积。先配pH 8.0的buffer(调pH需要较多NaOH)，再统一配bufferC，D，E，分别调pH Buffer B (200ml
分子克隆蛋白表达实验指南（二）
取DEPC水时切记带上手套 Genequant使用方法： 开机－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否为320nm)－set-ref(此时插入空白对照)－样品 1．使用前将比色皿中水吸出，用1ml蒸馏水重新洗涤再将比色皿中的水吸尽（先用1ml枪吸，后用100ul枪吸）
原核表达之目的基因克隆
1. 了解实验课题对目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除（即
分子克隆蛋白表达实验指南（十五）
LB固体培养基 Tryptone 1g Yeast Extract 0.5g NaCl 1g Agar 1.5g 加蒸馏水至总体
分子克隆蛋白表达实验指南（十）
13．连接产物转化DH5α（预开42C水浴） 与T载体转化相同，先转化DH5α，筛选及扩增目的重组质粒 转化DH5α后挑6～8个菌落验证，验证项目： 1． 目的基因引物PCR验证 2． 表达载体引物PCR验证 3． Step2中PCR产物胶回收后，以胶回收为模板、
有关融合蛋白表达载体的克隆
在构建融含蛋白表达载体时除了要注意插入片段的方向、读码框架与载体保持一致外，注意以下问题可能会减少一些不必要的麻烦，当外源片的插入载体起始密码的后面，另一个基因的前面时，注意检查插入后基因的两端是否引入了新的终止密码，特别是用到Klenow mung bean 核酸酶，T4 Polymerase
分子克隆蛋白表达实验指南（八）
15. 小量蛋白诱导表达 该步骤的目的是检测蛋白是否在上清存在表达。低温时蛋白易于表达于上清，因此小量蛋白诱导表达以20或30C为培养温度。 1. 挑一单克隆的菌落于5ml含有相应的抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜（8-16h）。 2. 过夜培养液加入三瓶50ml含
分子克隆蛋白表达实验指南（九）
SDS-PAGE胶样品排列： MUIBS1S1P1BS2S2P2UIT1T2T3T4 M：marker；上样10ul UI：未诱导对照；10ul BS：超声前样品；10ul S：超声后上清； 10ul P：超声后沉淀； 10ul T：诱导后每隔1h样品，1
小鼠βactin基因的克隆表达（4）
实验步骤：（1）诱导靶蛋白表达分别挑取对照菌和重组菌1~2个菌落，接入5ml含Amp（30μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养过夜。取5ml过夜培养物接入500ml含Amp（30μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数中期（A550=0.5~1.0）。向诱导管中加入IPTG使其浓
分子克隆蛋白表达实验指南（十九）
Desired pH Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL) 5.8 8.591.5 6.0 13.286.8 6.2 19.280.8