小鼠βactin基因的克隆表达(3)
(2)质粒的提取及酶切鉴定分析 质粒的提取按照质粒提取试剂盒的操作步骤进行,然后进行双酶切鉴定。 管号 ① ② 质粒DNA 10μl 10μl BamHⅠ 1μl 0μl BamHⅠ Buffer(10×) 2μl 2μl SalⅠ 2μl 0μl ddH2O ......阅读全文
有关融合蛋白表达载体的克隆
在构建融含蛋白表达载体时除了要注意插入片段的方向、读码框架与载体保持一致外,注意以下问题可能会减少一些不必要的麻烦,当外源片的插入载体起始密码的后面,另一个基因的前面时,注意检查插入后基因的两端是否引入了新的终止密码,特别是用到Klenow mung bean 核酸酶,T4 Polymerase
分子克隆-蛋白表达实验指南(十六)
Amp(50mg/ml) 溶解1g Amp于足量的水中,最后定容至20ml。分装成小份于-20℃贮存。常以20~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基,1:1000比例稀释 Kan(50mg/ml) 溶解1g Kan于足量的水中,最后定容至20ml
分子克隆-蛋白表达实验指南(十八)
15%胶 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5 30%聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
原核表达之目的基因克隆
1. 了解实验课题对目的蛋白的要求包括:目的蛋白分子量有多大,表达目的(是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体,不同目的对蛋白要求不同);是否要其可溶;是胞内表达还是分泌表达,是组成型表达还是诱导型表达;另外,还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化,纯化标签有多大,蛋白纯化后是否需要将标签去除(即
分子克隆-蛋白表达实验指南(十一)
SDS-PAGE胶样品排列: MarkerUII 37CUI’I’ Marker:低分子量蛋白marker,上样10ul UI:未诱导菌液,上样10ul。任取37C和20C中一个 I:诱导后对照,上样10ul UI’, I’代表G
分子克隆-蛋白表达实验指南(十七)
Buffers for His purification in denatured conditions: 配制时加终体积50%的水,之后定容至所需体积。先配pH 8.0的buffer(调pH需要较多NaOH),再统一配bufferC,D,E,分别调pH Buffer B (200ml
分子克隆-蛋白表达实验指南(三)
若有非特异性条带,可进行Touchdown PCR,提高引物的特异性。 PCR反应条件: 1 94C 5min 2 94C 45s 3 65C 45s 退火温度视
分子克隆-蛋白表达实验指南(十三)
7. 电泳结束后,按比例从胶上割下相应约1cm条带(当按比例的条带割下后可相应的向两边再割一点,但是电透析时中间和两边的胶必须分开透析),用镊子或尺子将胶碾碎成2mm见方的小块。 8. 将碎块小心加入电透析tube中,200V,120~150min。 9. 移出放电透析tube的架子,
分子克隆-蛋白表达实验指南(四)
7. PCR产物与TA载体连接 pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed. +A s
小鼠β-actin基因的克隆表达(2)
实验步骤: (1)目的基因与表达载体的连接反应: ①表达载体和目的片段的酶切 管号 ① ② pGEX 4T-1