miRNA克隆实验
实验方法原理 在细胞中表达的 RNA 除了我们所熟悉的 mRNA 以外，还有大量不编码蛋白质的非编码 RNA（noncoding RNA，ncRNA），非编码 RNA 在细胞中起着非常重要的作用，如 rRNA 和 tRNA 维持着基因的表达，还有一部分则起着调控基因表达的作用。实验材料 寡核苷酸乙腈ImpAp17.91X DEPC糖原T4 RNA 连接酶反转录酶dNTPDTTEDTAT4 DNA 连接酶BanⅠ限制性内切核酸酶Taq 酶M13F 引物M13R 引物试剂、试剂盒 混合液沉淀液上样液乙醇T4 RNA 连接酶缓冲液重蒸水KOHTris-HCl T4 RNA 连接酶缓冲液NEB 缓冲液溶胶溶液仪器、耗材 TOPO TA 克隆试剂盒实验步骤 一、材料与设备1. 寡核苷酸。2. 乙腈。3. 混合液 A：0.5 mmol AMP（5' 磷酸化）溶解于 15 ml 二甲基甲酰胺。4. 混合液 B：1 mmol 三......阅读全文
兔多克隆抗血清的制备实验
实验材料 抗原试剂、试剂盒 PBS乙醇仪器、耗材 注射针头注射器培养箱实验步骤 1. 取2 ml 的弗氏完全佐剂加到2 ml 的溶于PBS的纯化抗原中，使之乳化。用3 ml 注射器抽取此乳化液，接上22G注射针头，排出注射器中的气泡。 2. 将兔子敢在固定架上，用一只手抓住兔的颈背部毛皮，另一只
小量细菌克隆的杂交法筛选实验
实验方法原理 主琼脂板上和覆盖于另一块琼脂板表面的硝酸纤维滤膜或尼龙膜上的细菌克隆可以被定位， 经过一段时间，已经在滤膜上生长的克隆可以被原位裂解以备杂交之用。同时，主琼脂板可置于 4℃ 保存，直到筛选的结果出来为止。实验材料 E.coli试剂、试剂盒 LB 或 SOB 琼脂板仪器、耗材 硝酸纤维素
菌落－PCR－分析克隆的重组体实验
实验方法原理 菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。使用载体上的通用引物，进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用
细胞克隆实验操作的注意事项
（1）第一次开始培养某种细胞时，一定要在WWW. ATCC. ORG上用该细胞的名称进行检索，可以得到关于该细胞的详细信息，包括需要使用的培养基、血清、添加剂、通常的消化时间、传代时间等。对于特定的细胞（如原代培养的细胞），需要查阅相关文献来获得更准确的培养方法。（2）进入细胞间开始细胞培养时，必须
多克隆抗体纯化实验_辛酸提取法
辛酸提取法可用于分离提取人、兔、小鼠血清中的Ig及杂交瘤诱生的腹水和培养上清液中McAb。实验材料动物血清样品试剂、试剂盒正辛酸醋酸缓冲液PBS仪器、耗材透析袋高速低温离心机实验步骤一、材料和试剂 1. 正辛酸 2. 60 mmol/L，pH4.0醋酸缓冲液，PBS 3. 透析袋 4. 高
miRNA的特征、功能及识别方法等详解（二）
miRNA的作用方式最早被发现的两个miRNAs——lin-4 and let-7被认为是通过不完全互补结合到目标靶mRNA 3’非编码区端，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，阻断mRNA的翻译。多个果蝇miRNAs也被发现和他们的目标靶mRNAs的3’非编码区有部分同源
Isolation－of－microRNA－(miRNA)
实验概要 This protocol utilizes the powerful guanidine isothiocyanate–phenol:chloroform extraction method which allows the rapid isolation of t
micro－RNA(miRNA)综述3
未来要解决的问题miRNAs在多个物种中广泛被发现，而且在进化上高度保守。这些“小玩意儿”留给我们一大堆谜团：miRNA的确切功能是什么？它的目标靶是什么？作用机制是什么？也许需要对植物或者线虫的基因组进行miRNAs突变株的筛选，在果蝇中可以用targeted- disruption缺失miR
micro－RNA(miRNA)综述1
RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比RNA我们早前设想的更为重要。RNA干扰（RNA interference）的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化替代基因敲除而成为研究基因功能的
micro－RNA(miRNA)综述2
miRNA的作用方式最早被发现的两个miRNAs――lin-4 and let-7被认为是通过不完全互补结合到目标靶mRNA3'非编码区端，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，阻断mRNA的翻译。多个果蝇miRNAs也被发现和他们的目标靶mRNAs的3'非编码区
miRNA引物设计流程介绍
MiRNA的命名原则可以大致归纳如下： 一个系统命名包含三部分内容，即物种，microRNA类别，序号。三者间用短线连接。物种一般用三个小写字母表示，如hsa,mmu和rno分别代表人，小鼠和大鼠。MicroRNA类别是指所命名的microRNA是pre-miRNA还是mature miR
miRNA研究之RNA标记
RNA标记RNA标记是将标记物（如放射性同位素、荧光素或酶）共价地连接到RNA，通过检测标记物，进而实现对RNA鉴别和检测的目的。RNA标记在分子探针领域应用广泛，在疾病诊断方面也很有前景。 理想的RNA标记方法应符合以下要求：1. 操作简单，灵敏度高2. 不影响碱基配对的特异性3. 不影响R
miRNA引物设计流程介绍
MiRNA的命名原则可以大致归纳如下：一个系统命名包含三部分内容，即物种，microRNA类别，序号。三者间用短线连接。物种一般用三个小写字母表示，如hsa,mmu和rno分别代表人，小鼠和大鼠。MicroRNA类别是指所命名的microRNA是pre-miRNA还是mature miRNA。pre
小分子RNA（miRNA）简介
一、什么是小分子RNA（ MicroRNA）? MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为20-24个核苷酸长度的具有调控功能的非编码RNA。 miRNA 主要参与基因转录后水平的调控。这些miRNA基因首先在细胞核内转录成原始miRNA转录本（primary transcrip
中等量细胞克隆的杂交法筛选实验
实验方法原理 这一方法适用于任何大小的细菌克隆，但小的克隆可以给出最清楚的结果。小克隆可以产生尖锐的杂交信号，而且在克隆从琼脂板转到膜的过程中不会弥散。操作中 采用能够包含 2500 克隆的 90 mm 板效果最好。在保证
重组DNA的分离、克隆与测序实验手册
edited by Bruce A. Roe Judy S. Crabtreeand Akbar S. KhanDepartment of Chemistry and Biochemistry The Uni
单克隆抗体上清的制备实验2
实验材料抗体试剂、试剂盒PBS仪器、耗材离心机离心管实验步骤1. 同备择方案1中大规模制备MAb上清的步骤1~4，但等细胞长到合适的密度时就应收获细胞，或者是在细胞生长的平台期收获。 2. 将细胞倒入无菌的250 ml 锥形离心管中，于4℃ 250 g 离心15 min，弃上清。 3. 置细胞
单克隆抗体上清的制备实验1
实验材料杂交瘤试剂、试剂盒完全培养基仪器、耗材培养箱转子离心机实验步骤1. 将杂文瘤置于一个盛有完全DMEM-10培养基的175 cm2组织培养瓶中，置37 ℃CO2培养箱中，直至生长旺盛适于分传。2. 按1：10的比例将细胞分传到一个新的175 cm2的培养瓶中，加入完全DMEM-10培养液到
中等量细胞克隆的杂交法筛选实验
实验方法原理 这一方法适用于任何大小的细菌克隆，但小的克隆可以给出最清楚的结果。小克隆可以产生尖锐的杂交信号，而且在克隆从琼脂板转到膜的过程中不会弥散。操作中 采用能够包含 2500 克隆的 90 mm 板效果最好。在保证没有气泡的情况下，用更大的滤膜很难正好覆盖于 150 mm 板。实验材料
中等量细胞克隆的杂交法筛选实验
这一方法适用于任何大小的细菌克隆，但小的克隆可以给出最清楚的结果。小克隆可以产生尖锐的杂交信号，而且在克隆从琼脂板转到膜的过程中不会弥散。操作中采用能够包含 2500 克隆的 90 mm 板效果最好。在保证没有气泡的情况下，用更大的滤膜很难正好覆盖于 150 mm 板。本实验来源「分子克隆实验指南第
单克隆抗体上清制备实验——大量制备
实验材料目的杂交瘤试剂、试剂盒完全 DMEM-10 培养液（含 5～10 mmol／L HEPES pH 7.2～7.4）仪器、耗材250 ml 无菌锥形离心管转瓶培养装置850 cm2 旋转培养瓶175 cm2 组织培养瓶实验步骤1. 重复基本方案 1 步骤 1，并按 1:10 分传到终体积为 1
克隆化酵母DNA的操作实验——穿梭质粒
实验材料酵母实验步骤1. 构建其必需基因的染色体拷贝已被破坏的单倍体菌株，及带有完整的必需基因和URA3选择标志的YEp质粒。2. 将必需基因亚克隆到YCp载体（带有URA3以外的选择标志），取约10~20 μg 用羟胺或其他技术进行诱变。3. 转化至步骤1的菌株中，在添加了尿嘧啶的省却成分平
方案22.3－贴壁细胞的克隆形成实验
实验方法原理 用不同浓度的实验试剂将细胞处理24h 。经胰蛋白酶消化后，以低细胞密度接种，温育1～3 周，染色后（见彩图6a,e) 计集落数（图22.1)。 实验步骤
在质粒载体中进行定向克隆实验
在质粒载体中进行定向克隆实验 实验方法原理 大多数常用质粒都含有可被不同内切酶识别的多克隆位点。由于可供选择的克隆位点很多 [ 如 Invitrogen 公司
T克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因实验
【原理】经TaqDNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个A。正是基于这一原理，pGEM-T质粒经EcoRV切成平端后，在开口端加上一个T制成T载体，一方面避免了自身环化，另一方面由于T-A互补，从而提高了T载体与PCR产物之间的连接效率。由于T-A克隆只需纯化PCR产物，因而操作较为简便。pGE
分子克隆实验引入寄主细胞的常用方法
常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比
单克隆抗体鉴定实验试剂原理介绍
本试剂盒利用双抗体夹心法鉴定小鼠淋巴细胞杂交瘤培养上清中单克隆抗体或特异亲和纯化的单克隆抗体的类和亚类（可区分出IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA）。采用小鼠抗体共有位点的二抗包被微孔板，与加入的培养上清中的小鼠抗体结合，再加入HRP标记的抗小鼠各类、亚类的抗体来分别反应
在质粒载体中进行定向克隆实验
实验方法原理 大多数常用质粒都含有可被不同内切酶识别的多克隆位点。由于可供选择的克隆位点很多 [ 如 Invitrogen 公司的 PSE280 质粒的克隆位点有 46 个之多，而且还可以设计含有更多克隆位点的多聚接头（Brosius 1992 ) ]，因此一般来说总是能够找到一个带有与某一
小量细菌克隆的杂交法筛选实验步骤
小量细菌克隆的杂交法筛选实验步骤，一、材料1. 培养基含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板。含有氯霉素的 LB 或 SOB 琼脂板。2. 专用设备(1) 硝酸纤维素膜（Millipore HAWP，或类似产品）或尼龙膜。滤膜不必是无去污剂污染或无菌。(2) 注射器（3cc )，针头（18 号）
DNA片段的亚克隆实验——基本方案
所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。实验材料DNA试剂、试剂盒CIPdNTPDNA聚合酶T4聚