哺乳动物细胞瞬时基因转移法制备重组蛋白实验
一、转染方法对于脂质体转染 (Upofection), 可以从商业途径获得许多配方，这些配方都具有单一的ZL化组分，而且毫无疑问，它们中的大部分都能非常有效地将质粒 D N A 转 人 细 胞 。其缺点是价格不菲—- 在使用这些试剂时，对于超出数百毫升规模的瞬时转染，经济上是不可行的。大规模的瞬时转染方法要求转染试剂能很容易大量获取, 批次间的变化小以保证转染的一致性。尽管也存在一些其他的选择，如将壳聚糖 (chitosan) 及其衍生物和14D E A 2 作为转染试剂（D a n g and L e o n g , 2006; Jiang and Sharfstein， 2008; K u s u m o t oet a L ， 2 〇〇 6)，但磷酸钙（calcium phosphate) 介导的转染以及基于聚乙烯亚胺 (polyethylenimine，PEI) 的质粒络合 (plasmidc......阅读全文
哺乳动物细胞瞬时基因转移法制备重组蛋白实验
实验步骤 一、转染方法 对于脂质体转染 (Upofection), 可以从商业途径获得许多配方，这些配方都具有单一的ZL化组分，而且毫无疑问，它们中的大部分都能非常有效地将质粒 D N A 转 人 细 胞 。其缺点是价格不菲
哺乳动物细胞瞬时基因转移法制备重组蛋白实验
一、转染方法对于脂质体转染 (Upofection), 可以从商业途径获得许多配方，这些配方都具有单一的ZL化组分，而且毫无疑问，它们中的大部分都能非常有效地将质粒 D N A 转 人 细 胞 。其缺点是价格不菲—- 在使用这些试剂时，对于超出数百毫升规模的瞬时转染，经济上是不可行的。大
哺乳动物细胞瞬时基因转移法制备重组蛋白实验
报道显 TK，在 过 去 的 1 0 年 ，已经开发出 了多种高效的瞬时转染（transient transfection) 方法 ， 它们可 以 满 足 甚 至 超出 了 上 述 需 求 。 目 前 蛋 白 质 的 瞬 转 表 达 主 要 是 在H E K 2 9 3 衍生的细胞系中进行, 而同时
哺乳动物细胞基因稳定转染的实验
分析基因的功能常需要形成含有稳定整合了该基因的哺乳动物细胞系。在转染中大约有1/104细胞将稳定整合外源因而可用一显性（正向）选择标记来分离稳定的转化细胞。用可高效转染的细胞系来确保转染成功。另外，应包括合适的对照以确定目的基因无细胞毒性。实验材料哺乳动物细胞试剂、试剂盒完全培养液仪器、耗材培养箱离
哺乳动物细胞基因稳定转染的实验
基本方案 实验材料 哺乳动物细胞 试剂、试剂盒
哺乳动物细胞基因稳定转染的实验
实验材料 哺乳动物细胞试剂、试剂盒 完全培养液仪器、耗材 培养箱离心管实验步骤 1. 确定所要转染的细抱系能呈独立集落生长。对于贴壁细胞，在10 cm 组织培养培养皿中接种约100个细胞，培养10~12天，毎4天换液1次。亚甲蓝染色后对成活的细胞集落进行计数。 2. 确定母代细胞的选择条件：将一
DNA重组（DNA－recombination）技术：外源基因的蛋白表达3
（6）遗传标记： 从成千上万个哺乳细胞中，检测出极少数的含DNA重组体的转染细胞，并鉴定已导入外源DNA是哺乳动物细胞基因表达系统的一个关键内容。因此，在真核生物表达载体上必须附有标记基因，才能进行筛选。常用的标记基因有：胸苷激酶基因（thymidine kinase，TK）、二氢叶酸还原酶
哺乳动物细胞真核表达系统为科学研究提供助力
哺乳动物细胞真核表达系统是哺乳动物细胞经过翻译和再加工后产生的外源蛋白，在活性上远优于原核表达系统和酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近天然蛋白。哺乳动物细胞表达系统可以提供较接近自然状态的重组人蛋白的翻译后修饰。在蛋白质表达过程中，会形成接近天然蛋白质的蛋白质折叠和聚合，具有活性蛋白质所必需的
重组蛋白的高产量瞬时表达
图a. 用ELISA法测得培养液中IgG的含量；横轴为天数，纵轴为IgG滴度。 采用高密度瞬时转染（High-density transfection）的方法，可以在HEK-293 EBNA1细胞中大量表达重组蛋白。实验表明，该方法具有操作简单，培养周期短，转染效率高，批次产量高的优
蛋白质在哺乳动物细胞中表达实验
实验材料载体（如 CDM 8）实验步骤1. 将目的基因亚克隆至合适的载体中得到所需的重组 DNA 。用小量法（5 ml 培养液）或用 CsCl／溴化乙锭离心法纯化重组 DNA。2. 在转染的前一天，将 COS-7 细胞以约 20% 汇片的数量种入含 DMEM-2 CS 培养基的 100 mm 培养皿
蛋白质在哺乳动物细胞中表达实验
基本方案 用COS细胞瞬时表达 实验方法原理 实验材料 载体（如 CD
蛋白质在哺乳动物细胞中表达实验
实验方法原理 实验材料 载体（如 CDM 8）实验步骤 1. 将目的基因亚克隆至合适的载体中得到所需的重组 DNA 。用小量法（5 ml 培养液）或用 CsCl／溴化乙锭离心法纯化重组 DNA。2. 在转染的前一天，将 COS-7 细胞以约 20% 汇片的数量种入含 DMEM-2 CS 培养基的 1
药物研发的好帮手蛋白质表达系统
近年来，随着生物药市场和基因工程技术的发展，重组治疗性抗体或者单抗的需求在生物药中的比例也逐年上升。重组mAbs被应用于包括癌症及免疫系统缺陷在内的许多疾病的治疗当中。 重组mAbs通过基因工程技术改造后可以在多种宿主细胞表达。重组mAbs在表达后进行翻译后修饰、蛋白质折叠、组装及适当的糖
哺乳动物细胞真核表达系统的优势有人想知道吗
哺乳动物细胞真核表达系统则是通过脂质体或者是PEI的等转染试剂在体外通过和质粒形成复合体， 将质粒导入细胞后进行瞬时表达。称为瞬时表达的原因是因为质粒在真核细胞中不能扩增。并且不断被细胞所降解，这种表达在一定的时间后就会消失。除非质粒被整合进入细胞的基因组，通过质粒上带的筛选标记，通过筛选得到
哺乳动物中制备基因组DNA实验——制备DNA
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。实验材料动物组织试剂、
哺乳动物细胞基因突变试验
哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验常用的测试系统有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞，中国仓鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的三个基因位点的突变，即次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+／K+ATP酶(OUA)位点。HGRPT和Na+/K+ATP酶位点突变可用于上述三种细胞，O
基因物质的转移和重组
（1）转化：是受体菌直接摄取供体菌提供的游离DNA片段整合重组，使受体菌的性状发生变异的过程。（2）转导：是以温和噬菌体为媒介，将供体菌的基因转移到受体菌内，导致受体菌基因改变的过程。（3）接合：是受体菌和供体菌直接接触，供体菌通过性菌毛将所带有的F质粒或类似遗传物质转移至受体菌的过程。（4）溶原性
基因的转移与重组（一）
遗传型变异还可通过两个不同性质细菌之间发生遗传物质的转移和重组而实现。在基因转移中，提供DNA的细菌为供体，而接受DNA的细菌是受体。基因转移后获得重组的子代，即具有供体与受体菌二者的主要特性。实现基因转移需要两个基本条件：一是全部或部分供体菌的基因相应进入受体菌；二是在受体菌中形成重组（杂交)
基因的转移与重组（二）
二、转导 以噬菌体为媒介，把供细菌的基因转移到受体菌内，导致后者基因改变的过程称为转导。 当噬菌体在细菌中增殖并裂解细菌时，某些DNA噬菌体（称为普遍性转导噬菌体)可在罕见的情况下（约105～107次包装中发生一次)，将细菌的DNA误作为噬菌体本身的DNA包入头部蛋白衣壳内。当裂解细菌后，释
药物研发的好帮手—蛋白质表达系统
近年来，随着生物药市场和基因工程技术的发展，重组治疗性抗体或者单抗的需求在生物药中的比例也逐年上升。重组mAbs被应用于包括癌症及免疫系统缺陷在内的许多疾病的治疗当中。重组mAbs通过基因工程技术改造后可以在多种宿主细胞表达。重组mAbs在表达后进行翻译后修饰、蛋白质折叠、组装及适当的糖基化才能具有
哺乳动物中制备基因组DNA实验
制备DNA 实验材料 动物组织
哺乳动物中制备基因组DNA实验
实验材料 动物组织试剂、试剂盒 PBS乙酸铵乙醇酚氯仿异戊醇TE仪器、耗材 离心机摇床研钵实验步骤 1. 切下组织并立即剪成小块，置于液氮中冻结。 2. 将200 mg~1 g 的组织用预冷的研钵和研杵研碎，或用锤子将其捣为细粉末，每100 mg 组织用1. 2 ml 消化缓冲液悬浮。 3.
真核细胞表达系统3
由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高，即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒，将其线性化后与腺病毒包装质粒
DNA重组（DNA－recombination）技术：外源基因的蛋白表达4
（3）CHO细胞稳定表达系统：动物细胞瞬时表达系统中外源基因没有稳定地整合到宿主细胞染色体中，一染色体外DNA的形式存在。因而只能瞬时表达。要使外源基因在宿主细胞中高效、稳定地表达，必须建立一个稳定表达系统，包括适宜的表达载体、有效的基因转染、标记基因和目标基因的选择与共扩增、受体适当的受体细胞和培
基因物质转移和重组的途径
（1）转化：是受体菌直接摄取供体菌提供的游离DNA片段整合重组，使受体菌的性状发生变异的过程。（2）转导：是以温和噬菌体为媒介，将供体菌的基因转移到受体菌内，导致受体菌基因改变的过程。（3）接合：是受体菌和供体菌直接接触，供体菌通过性菌毛将所带有的F质粒或类似遗传物质转移至受体菌的过程。（4）溶原性
细菌基因物质的转移和重组
1.转化：受体菌直接摄取供体菌提供的游离DNA片段整合重组。2.转导：以噬菌体为媒介 ，将供体菌的基因转移到受体菌内。3.接合：性菌毛 将供体菌所带有的F质粒或类似遗传物质转移至受体菌的过程。主要见于革兰阴性菌。4.溶原性转换：噬菌体的DNA与细菌染色体重组。5.原生质体融合：两种失去细胞壁的原生质
哺乳动物细胞体外剪接分析实验
剪接反应的典型做法是使用核提取物，即 S100 提取物补充 SR 蛋白或粗提取物的部分纯化组分，最常使用的是 HeLa 细胞的提取物。前体 mRNA 底物通常采用噬菌体聚合酶体外转录的方法来制备。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编：郑晓飞。实验方法原理剪接反应的典型做法是使用核提取物，即 S10
哺乳动物细胞体外剪接分析实验
实验方法原理 剪接反应的典型做法是使用核提取物，即 S100 提取物补充 SR 蛋白或粗提取物的部分纯化组分，最常使用的是 HeLa 细胞的提取物。前体 mRNA 底物通常采用噬菌体聚合酶体外转录的方法来制备。实验材料 前体 mRNA 底物试剂、试剂盒 ATP CP 混合物HEPES-KOH聚乙烯醇
哺乳动物细胞体外剪接分析实验
实验方法原理 剪接反应的典型做法是使用核提取物，即 S100 提取物补充 SR 蛋白或粗提取物的部分纯化组分，最常使用的是 HeLa 细胞的提取物。前体 mRNA 底物通常采用噬菌体聚合酶体外转录的方法来制备。
哺乳类动物的基因转移方法
哺乳类动物基因转移方法，是将改建后的目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵（或着床前的胚胎细胞），然后将此受精卵（或着床前的胚胎细胞）再植入受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。 根据外源基因导入的方法和对象的不同，制作转基因动物的方法主要有显微注