DNA片段的亚克隆实验
实验材料 DNA试剂、试剂盒 CIPdNTPDNA聚合酶T4聚合酶DTTATP仪器、耗材 水浴锅电泳仪培养箱实验步骤 1. 在20 μl 反应体积内用合适的酶完全消化DNA。75℃加热15 min，灭活酶。如若无需进一步的酶促处理，接歩骤6。2. 如果5’磷酸需要去除，加入2 μl 10×CIP缓冲液和1 U CIP，37℃温育30~60 min，75℃加热15 min终止反应。如无进一步的酶促处理，接步骤 6。3. 如果1个或2个末端需变为平端，加入1 μl 含4种dNTP混合液（每种0.5 mmol/l） 和适量klenow酶或T4 DNA聚合酶，温育（见图一），75℃加热15 min 化终止反 应。如果只需1个平端，可用适当的酶消化。如无进一步的酶促处理，接步骤6。4. 若需加人寡核苷酸接头，加入0.1~1.0 μg 的合适的寡核苷酸接头，1 μl 10 mmol/l......阅读全文
DNA片段的亚克隆实验
基本方案 凝胶块中DNA连接 实验材料 DNA 试剂、试剂盒
DNA片段的亚克隆实验
实验材料 DNA试剂、试剂盒 CIPdNTPDNA聚合酶T4聚合酶DTTATP仪器、耗材 水浴锅电泳仪培养箱实验步骤 1. 在20 μl 反应体积内用合适的酶完全消化DNA。75℃加热15 min，灭活酶。如若无需进一步的酶促处理，接歩骤6。2. 如果5’磷酸需要去除，加入2 μl 10×CIP
DNA片段的亚克隆实验——基本方案
所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。实验材料DNA试剂、试剂盒CIPdNTPDNA聚合酶T4聚
DNA片段的亚克隆实验——凝胶块中DNA连接
实验材料DNA试剂、试剂盒TAE琼脂糖仪器、耗材电泳仪离心机实验步骤1. 重复基本方案中的步骤1~5。 2. 在高质量的低融点胶中分离久DNA（0.7%，TAE缓冲液），切下体积尽可能小的所需DNA条带（20~50 μl ）至小离心管中。3. 在70℃融化低融点胶10 min 以上，每个连接反
分子克隆实验DNA片段与载体连接方法介绍
DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头
外源DNA片段在质粒载体中的克隆实验
克隆法 实验方法原理 限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上
外源DNA片段在质粒载体中的克隆实验
NA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。主要用于（1）外源性基因转染；（2）对外源性基因的转化分离。实验方法原理限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；
分子克隆化DNA片段的制备介绍
常用以下方法获得DNA片段： ①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段； ②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段； ③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段； ④从mRNA反转录产生cDNA。
用大片段基因组－DNA－克隆直接筛选－cDNA实验
试剂、试剂盒 扩增缓冲液 DNA 聚合酶 DNaseI 限制性内切核酸酶 ATP 链霉亲和素-磁珠结合缓冲液 T4DNA 连接酶
用大片段基因组－DNA－克隆直接筛选－cDNA实验
本方案使用克隆在 BAC 载体上的一段 500kb 的人基因组 DNA 连续序列，直接筛选与其互补的的 cDNA。但本方法也可适用于任意大小的基因组靶 DNA。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）上册，作者：黄培堂。试剂、试剂盒扩增缓冲液DNA 聚合酶 DNaseI限制性内切核酸酶ATP链霉亲和素
用大片段基因组－DNA－克隆直接筛选－cDNA实验
试剂、试剂盒 扩增缓冲液DNA 聚合酶 DNaseI限制性内切核酸酶ATP链霉亲和素-磁珠结合缓冲液T4DNA 连接酶热稳定 DNA 聚合酶琼脂糖凝胶BACDNA缺口平移缓冲液杂交液平末端 cDNACot1 基因组 DNA胞浆 poly(A)+RNAdNTP 溶液DNA 分子质量标志物寡
DNA片段的回收实验
树脂回收法 微量柱法 液氮冻融法 常规方法 实验方法原理 本方法特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经此方法
DNA片段的回收实验
实验方法原理 本方法特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程，PCR产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离出来，成为高度无盐的、不含其他大分子成分的纯化片断。在较宽的分子量范围内有较高的回收
外源DNA片段在质粒载体中的克隆实验原理和步骤
DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。 实验目的： 学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上
分子克隆化DNA片段与载体连接介绍
DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有： ①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。 ②平头末端连接，用物理方法制备的DN
DNA片段探针的应用实验
实验材料 DNA试剂、试剂盒 杂交液洗膜液仪器、耗材 注射器超声仪水浴锅实验步骤 1. 用5~20 ml 杂交液Ⅰ依次浸泡10~20张硝酸纤维素滤膜。滤膜装入杂交袋中，加入足够的杂交液，密封后42℃预杂交1 h。 2. 往带螺盖的试管中，加入放射性探针和2 mg 超声波处理的鲱鱼精DNA，煮沸1
DNA片段探针的应用实验
甲酰胺法 水溶液中杂交 实验材料 DNA 试剂、试剂盒
含有RecA的目标片段经T4－DNA聚合酶处理后的SLIC亚克隆
实验概要SLIC(Sequence and Ligation Independent Cloning)是一种不依赖于基因序列和连接反应的高效基因克隆新方法，它可以实现体外同源重组反应中多个DNA片段在单一反应中的装配和单链的退火。实验步骤1．用限制性内切酶处理2微克载体，使用QIAEX II凝胶提取
克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定
实验方法原理 已转化的重组载体的细菌细胞或 λ 噬菌体颗粒可通过直接从培养皿上挑取菌落或噬菌斑获得，然后直接加入到 PCR 混合液中，这时 PCR 混合液中含有除了未加热稳定 DNA 聚合酶外的所有试剂，其中引物与所要鉴定的已克隆 DNA
克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定
已转化的重组载体的细菌细胞或 λ 噬菌体颗粒可通过直接从培养皿上挑取菌落或噬菌斑获得，然后直接加入到 PCR 混合液中，这时 PCR 混合液中含有除了未加热稳定 DNA 聚合酶外的所有试剂，其中引物与所要鉴定的已克隆 DNA 片段的侧翼序列互补。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。实验方
克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定
实验方法原理 已转化的重组载体的细菌细胞或 λ 噬菌体颗粒可通过直接从培养皿上挑取菌落或噬菌斑获得，然后直接加入到 PCR 混合液中，这时 PCR 混合液中含有除了未加热稳定 DNA 聚合酶外的所有试剂，其中引物与所要鉴定的已克隆 DNA 片段的侧翼序列互补。实验材料 热稳定 DNA 聚合酶正义和反
外源DNA片段在质粒载体中的克隆实
实验方法原理 限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。实验材料 DNA片段PUC18试剂
DNA片段的回收实验——常规方法
实验材料NA片段试剂、试剂盒纯化试剂盒异丙醇仪器、耗材离心机电泳仪电泳槽取液器微量真空装置抽滤装置实验步骤1. PAGE电泳，如EB染色的则在紫外灯下切下目的片断，如龈染或其他非放染色的则在关下切下目的片断。2. 用少量脱缓冲液I将目的片断胶条洗至一Eppendorf管中，用玻棒将凝胶捣碎，用1
DNA片段的回收实验——微量柱法
实验材料DNA片段试剂、试剂盒纯化试剂盒异丙醇仪器、耗材离心机电泳仪电泳槽取液器微量真空装置抽滤装置实验步骤1. 紫外灯下从胶上切下目的片段，放入一Epphendof管中。2. 离心管在－20℃冷却5~10分钟。3. 将微量柱下套上一Epphendof管，将冷却的胶条装进微量柱中，4℃12 0
DNA片段的回收实验——树脂回收法
目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片断。实验方法原理本方法特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程，PCR产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离
分子克隆技术(质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应...1
克隆（Clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆（Molecular Cloning）是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群，发生在基因水平上的分子克隆称基因克隆（DNA克隆）。其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（
分子克隆技术(质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应...2
PCR引物决定PCR的特异性，引物的设计就显得尤为重要。下面以已知DNA序列设计引物为例介绍设计引物应考虑的几个方面：1、GC比值：众所周知,碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR中退火温度的重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半即可。2、长
克隆化酵母DNA的操作实验
实验材料 酵母实验步骤 将待研究的基因亚克隆到YIP质粒。2. 用限制性内切酶在克隆化基因内部切开，使质粒线性化。3. 用1~10 μg DNA加上担体DNA转化适合的菌株，通过质粒上带的标记进行选择，在选择培养基上纯化几个转化子，制备DNA，应用Southern 杂交确证整合是否发生在所期
分子克隆实验载体DNA的选择
①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的
亚克隆的定义
从一个克隆的DNA片段上分割几个区域，分别将之克隆到新的载体上，获得一系列新的重组子。