原核表达载体的构建介绍
1、获得目的基因 （1）通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 （2）通过RT-PCR方法：提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 2、构建重组表达载体 （1）载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 （2）PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 3、获得含重组表达质粒的表达菌种 （1） 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 （2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 （3）......阅读全文
原核表达载体的构建介绍
1、获得目的基因 （1）通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 （2）通过RT-PCR方法：提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物
真核基因表达载体的构建
提高目的基因在哺乳动物细胞中表达的策略：1、DNA水平：增加基因拷贝数(1)高拷贝载体；（2）基因共扩增；2、转录水平：利用强启动子、增强子，可诱导启动子，如CMV、Tet；3、翻译水平：优化翻译起始序列和非编码区序列。本篇文章来源于网络，如有异议请联系我们，我们将在3个工作日内作出处理。
关于原核表达载体原件SD序列的介绍
1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3¢；末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序
关于原核表达载体的原件终止子的介绍
在一个基因的3¢；末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来
关于原核表达载体的原件启动子的介绍
启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成
真核表达载体pcDNA3.1GFP的构建
【原理】引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计不同酶切位点时，可有效地定向克
RNAi表达载体构建
近年来的研究表明，一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型， 称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子，能够
RNAi表达载体构建
近年来的研究表明,一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子,能够
原核表达
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择
原核表达
基因克隆技术 实验方法原理 一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测
siRNA表达载体的构建
siRNA表达载体构建可应用于：（1）作为后基因组时代基因功能分析的有力工具；（2）基因组学、细胞信号传导通路分析；（3）药物靶点筛选、疾病治疗。实验方法原理多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RN
siRNA表达载体的构建
实验方法原理 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol
siRNA表达载体的构建
实验方法原理 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U
植物表达载体的构建
实验概要本实验介绍了一种构建植物表达载体的方法。实验步骤1. 植物正义表达载体的构建 1) 用SmaI和SacI双酶切pTriplEx2-GhMT3a和植物表达载体pBI121： 2) 进行琼脂糖凝胶电泳，回收GhMT3a片段和pBI121载体； 3) 连接：连接体系为：混匀后4-
RNAi表达载体构建（二）
（2）、序列同源性分析: 将潜在的序列和相应的基因组数据库（人,或者小鼠,大鼠等等）进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列.例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成.并非所有符合条件的siRNA都一样有效,其原因还不清楚
RNAi表达载体构建（一）
近年来的研究表明,一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分
原核表达操作流程
实验概要本实验介绍了原核表达的具体操作流程，包括：外源基因的诱导表达，大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化。实验原理1. E. coli 表达系统E. coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E. coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE
Tec真核表达载体构建及其对细胞信号的影响实验
实验方法原理研究认为Tec有肝组织与造血组织分布特异性，主要与EPO、EGF、IL6、GM CSF等细胞因子介导的信号转导途径密切相关，参与调控造血细胞尤其是淋巴细胞的增殖与分化。实验材料大鼠
Tec真核表达载体构建及其对细胞信号的影响实验
实验方法原理研究认为Tec有肝组织与造血组织分布特异性，主要与EPO、EGF、IL6、GM CSF等细胞因子介导的信号转导途径密切相关，参与调控造血细胞尤其是淋巴细胞的增殖与分化。实验材料大鼠试剂、试剂盒引物鼠重组肝细胞生长因子DMEM胰酶胎牛血清仪器、耗材PCR仪PVDF实验步骤一、材料准备1.
基因编辑鼠－sgRNA表达载体构建
继上次发表的Guide RNA设计和筛选的相关知识之后，希望大家还没有忘记相关的操作和技巧，今天，我们就来和大家聊聊后续的实验，在基因编辑鼠的过程中，sgRNA表达载体是如何构建的呢？在靶点筛选结束之后，下一步就要进行sgRNA载体构建。在构建表达载体前，应根据实验目的选取合适的表达质粒。比如进行实
靶向－EGFR基因－siRNA表达载体的构建
实验材料靶向EGFR基因siRNA试剂、试剂盒pSilencer2.1-U6载体EcoR IBamH IT4 DNA连接酶鼠抗人anti-EGFRFITC标记兔抗小鼠IgGCy3标记兔抗小鼠IgG甘油多聚甲醛二甲基亚砜仪器、耗材流式细胞仪荧光显微镜二氧化碳细胞培养箱酶标仪培养板盖玻片载玻片利用Lip
酵母表达载体的构建与酵母转化
实验概要本实验介绍了酵母表达载体的构建、酵母转化方法及酵母抗逆实验。主要试剂试剂配制：1 .1 M Tris.Cl(pH 7.5)(100 ml)：12.1g Tris碱，加80 ml ddH2O，浓HCl调pH 7.5，定容至100 ml；2. 0.5 M EDTA(pH 8.0) (100 ml
含有目的基因真核表达－pEGFPC1载体的构建实验_转化
实验方法原理转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（Rˉ，Mˉ），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞
真原核基因表达的区别
1、原核生物染色体为一个基因连锁群，而真核为两个或以上，当一个有缺陷时另一个可以补充；2、原核生物染色体不与组蛋白结合，省去的解聚的步骤；3、原核生物的转录与翻译都在同一区间，而真核是分开的；4、真核生物基因内有内含子，mRNA会有一个自我剪接的修饰过程，原核生物则不会；5、真核生物蛋白质的翻译后修
筛选质粒载体构建表达文库实验
试剂、试剂盒 封闭缓冲液 氯仿 裂解缓冲液 检测抗原-抗体复合物所用试剂 SM TNT 缓冲液 洗涤缓冲液
筛选质粒载体构建表达文库实验
检测结合抗体的方法有以下 3 种：放射化学筛选，生色反应筛选及化学发光反应筛选。3 种方法的优缺点在本章导言中有所论述。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。试剂、试剂盒封闭缓冲液氯仿裂解缓冲液检测抗原-抗体复合物所用试剂SMTNT 缓冲液洗涤缓
筛选质粒载体构建表达文库实验
试剂、试剂盒 封闭缓冲液氯仿裂解缓冲液检测抗原-抗体复合物所用试剂SMTNT 缓冲液洗涤缓冲液 125I 标记的蛋白质 A 或 125I 标记的免疫球蛋白放射性碘化第二抗体第一抗体LB 或 SOB 琼脂平板仪器、耗材 空气培养箱平头镊子 装有防水黑墨水（印度墨水）并带有 18 号针头的注射器硝酸纤维
上海生科院构建细胞核内长非编码RNA的新型表达载体
11月5日，国际学术期刊Nucleic Acids Research在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所陈玲玲研究组关于研究细胞核内长非编码RNA的新型表达载体。该研究首次构建了一种可以将外源过表达的RNA滞留在细胞核内的载体（snoVector），而且过表达的RN
含有目的基因真核表达－pEGFPC1载体的构建实验_质粒提取
试剂、试剂盒质粒提取试剂盒限制性核酸内切酶仪器、耗材离心机振荡培养箱电泳装置冰盒恒温水浴箱实验步骤1. 挑取含有目的DNA重组体的单个菌落接种在3 ml LB（含有Amp或Kan）液体培养基中，37 ℃，225 rpm培养12～16 hrs。 2. 提取质粒 ⑴离心菌液，废弃上清。 ⑵加入250
含有目的基因真核表达－pEGFPC1载体的构建实验_克隆法
实验方法原理在设计引物时,一对引物两端分别加了两个酶切位点,这两个酶切位点与pEGFP-C1 载体多克隆位点中的酶切位点相吻合,且位置和方向都合适。这样, 目的基因片段和pEGFP-C1 载体经双酶切后,由于酶切位点一致,在T4 DNA 连接酶的作用下就可以连接。实验材料DNA 片段试剂、试剂盒pE